PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VIRIO CHOLERA TRONG NƯỚC THẢI

Phương pháp phân tích virio cholera trong nước thải

Vibrio cholerae là một loài vi trùng gram âm gây bệnh tả ở người, tồn tại trong phân người và động vật, lây lan theo đường tiêu hóa.

Người bệnh có biểu hiện đặc trưng bao gồm đau bụng, nôn mửa và tiêu chảy ồ ạt đến biến chứng mất nước nặng nề và suy kiệt. Lịch sử thế giới đã ghi nhận 7 vụ đại dịch tả xảy ra trên nhiều châu lục và cướp đi sinh mạng của hàng triệu người.

Vì sự nguy hiểm của mầm bệnh này nên việc phát hiện sớm mầm bệnh sẽ giảm thiểu được thiệt hại về cả kinh tế cho doanh nghiệp, cơ sở sản xuất và sức khỏe cho người sử dụng.

 

I. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN TẢ VIBRIO CHOLERAE (PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VIRIO CHOLERA)

• Đặc điểm hình thể:
• Vi khuẩn hình que cong hình dấu phẩy lên được gọi là phẩy khuẩn tả, bắt màu gram âm.
• Có khả năng di động nhờ có 1 lông ở đầu.
• Không sinh nha bào.
• Đặc điểm nuôi cấy:
• Là vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối (vi khuẩn cần oxy để phát triển), khó phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường và phát triển tốt ở môi trường kiềm cao muối mặn.
• Sống tốt trong môi trường nước, thức ăn như cá, cua; chịu được lạnh tốt. Vi khuẩn tả bị tiêu diệt ở nhiệt độ 80⁰C/ 5 phút hoặc hóa chất diệt khuẩn thông thường như acid.

• Độc tố: vi khuẩn sinh độc tố ruột là kháng nguyên có bản chất protein. Độc tố này khi vào ruột non người gây ra phản ứng làm giảm ion Na⁺ và tăng tiết ion Cl^– gây tiêu chảy

• Khả năng gây bệnh ở người: vi khuẩn gây bệnh cho người ở điều kiện tự nhiên. Triệu chứng bệnh là nôn và tiêu chảy nhiều dẫn đến tình trạng mất nước, điện giải trầm trọng gây ảnh hưởng đến tính mạng. Bệnh thường xảy ra vào mùa hè có thể bùng phát thành dịch.

Bệnh lây qua đường tiêu hóa: qua thức ăn, nước uống. Nguồn lây là người bệnh và người lành mang vi khuẩn.

 

II. PHÂN TÍCH VIRIO CHOLERA TRONG NƯỚC (PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VIRIO CHOLERA)

 

1.  Phương pháp phân tích Vibrio Cholerae trong nước

Hướng dẫn phân tích Vibrio Cholerae trong nước theo SMEWW 9278:2023

 

2.  Lấy và bảo quản mẫu

• Lấy mẫu vào các chai polyetylen đã rửa sạch và khử trùng bằng nồi hấp ở 121⁰C trong 15 phút. Việc phân tích nên tiến hành càng sớm càng tốt, nếu chưa thể thực hiện thì đem bảo quản mẫu ở nhiệt độ 2-8⁰

 

3. Thiết bị, dụng cụ

• Tủ sấy hơi nóng để sấy khô: 011-TS/TBHH-PT
• Nồi hấp tiệt trùng 121⁰C: 044-NH/TBHH-PT, 026-NH/TBHH-PT
• Tủ ấm được điều chỉnh ở nhiệt độ 36⁰C: 039-TA/TBHH-PT, 017-TA/TBHH-PT
• Bếp điều nhiệt: 062-WB/TBHH-PT
• Thiết bị lọc màng: 034-BHCK/TBHH-PT
• Màng lọc khử khuẩn 0,45 mm
• Ống nghiệm, Đĩa petri
• Pippet 1ml, 10ml
• Đèn cồn
• Chai thủy tinh 100m
• Đũa thủy tinh

 

4. Môi trường và hóa chất (PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VIRIO CHOLERA)

 

4.1. Môi trường

Môi trường tăng sinh chọn lọc

Alkaline Pepton Water (APW): hòa tan 20 g môi trường APW (V21) trong 1000ml nước cất, môi trường được phân phối thành các dung tích 10ml vào ống nghiệm, đem hấp khử trùng bằng nồi hấp áp lực 121⁰C trong 15 phút. Chuẩn bị trước khi thí nghiệm hoặc bảo quản lạnh ở nhiệt độ 2-8⁰C sử dụng trong 1 tháng.

 

Môi trường khẳng định

• Thiosulfate Citrate Bile (TCBS): hòa tan 89,08 g môi trường TCBS (V11) trong 1000ml nước cất, đem đun nóng cho đến khi môi trường tan hoàn toàn, không hấp khử trùng bằng nồi hấp áp lực.
• CHROMagar Vibrio (CAV): hòa tan 74,7g môi trường CAV trong 1000ml nước cất, đem đun nóng cho đến khi môi trường tan hoàn toàn, không hấp khử trùng bằng nồi hấp áp lực.
• Sau khi được làm nguội đến 45 – 50⁰C, môi trường được phân phối thành các dung tích 12 – 15ml vào các đĩa petri vô trùng, để yên trên bề mặt phẳng cho đĩa đông lại . Các đĩa petri này có thể sử dụng ngay hoặc được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2-8⁰C cho đến khi sử dụng.
• Blood agar (BA): hòa tan 40 g môi trường BA (V58) trong 950 ml nước cất, đem đun nóng cho đến khi môi trường tan hoàn toàn, hấp khử trùng bằng nồi hấp áp lực 121⁰C trong 15 phút.

Sau khi được khử trùng và làm nguội đến 45 – 50⁰C, bổ sung 5-7% máu cừu theo thể tích môi trường pha. môi trường được phân phối thành các dung tích 12 – 15ml vào các đĩa petri vô trùng, để yên trên bề mặt phẳng cho đĩa đông lại.

Các đĩa petri này có thể sử dụng ngay hoặc được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2-8⁰C cho đến khi sử dụng.

 

Môi trường cấy truyền

• TSA: hòa tan 40 g môi trường TSA trong 1000ml nước cất, đem đun nóng cho đến khi môi trường tan hoàn toàn, hấp khử trùng bằng nồi hấp áp lực 121⁰C trong 15 phút.
• Sau khi được khử trùng và làm nguội đến 45 – 50⁰C, môi trường được phân phối thành các dung tích 12 – 15ml vào các đĩa petri vô trùng, để yên trên bề mặt phẳng cho đĩa đông lại . Các đĩa petri này có thể sử dụng ngay hoặc được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2-8⁰C cho đến khi sử dụng.

 

4.2. Thuốc thử sinh hóa

• Bộ kit test nhanh nkIDS 14 GNR (Hệ thống định danh trực khuẩn gram âm)
• Tryptone broth: hòa tan 20 g môi trường Tryptone broth trong 1000ml nước cất, đem đun nóng cho đến khi môi trường tan hoàn toàn, bổ sung NaCl lần lượt với nồng 0%, 3%, 6%, 8% và 10% NaCl, phân phối thành các dung tích 5 – 10ml vào các ống nghiệm, hấp khử trùng bằng nồi hấp áp lực 121⁰C trong 15 phút. Các ống môi trường này có thể sử dụng ngay hoặc được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2-8⁰C cho đến khi sử dụng.
• Giấy thử oxidase

 

5. Kiểm soát chất lượng

• Chủng chứng dương cholera NCTC 11348, nồng độ sử dụng < 10² tế bào.
• Mẫu trắng: sử dụng dung dịch BPW.
• Chủng chứng âm: coli ATCC 25922, nồng độ sử dụng > 10³ tế bào

 

6.  Quy trình phân tích

 

6.1. Mẫu thử nghiệm

 

6.1.1. Tăng sinh mẫu trong môi trường chọn lọc

• Lọc một thể tích mẫu nước 100ml qua một màng lọc có đường kính lỗ thích hợp có khả năng giữ lại các vi khuẩn.
• Sau khi lọc, dùng kẹp vô trùng chuyển màng lọc vào bình vô trùng chứa 50 ml môi trường Alkaline Peptone water (APW). Ủ môi trường ở 36⁰C trong 6 – 8h.

 

6.1.2. Khẳng định trên môi trường chọn lọc

• Sử dụng dịch cấy thu được, dùng que cấy vòng vô khuẩn lấy 1 vòng dịch bề mặt cấy lên bề mặt môi trường TCBS, BA và môi trường CAV.
• Ủ ở 37⁰C trong 24 h.
• Đọc các khuẩn lạc đặc trưng và tiến hành xác định sinh hóa.
• Các khuẩn lạc điển hình của Vibrio cholera trên môi trường TCBS: Khuẩn lạc màu vàng phẳng, đường kính 2-3 mm.
• Các khuẩn lạc điển hình của Vibrio cholera trên môi trường BA: Khuẩn lạc làm tan huyết trên đĩa thạch.
• Trên môi trường CAV, Vibrio cholerae cho khuẩn lạc màu xanh lá đến xanh lam.

 

6.1.3. Cấy truyền

• Tiến hành cấy truyền các khuẩn lạc điển hình sang môi trường TSA và xác định sinh hóa.

 

6.1.4. Xác định sinh hóa

 

Phản ứng oxidase

• Lấy khuẩn lạc thực hiện phản ứng oxidase bằng giấy thử oxidase. Đọc kết quả trong vòng 10s đầu. Nếu xuất hiện màu tím sẫm là phản ứng dương tính, không màu là phản ứng âm tính.

Vibrio cholera cho phản ứng dương tính (+)

 

Phép thử khả năng chịu mặn

• Chuẩn bị một dãy các dung dịch tryptone broth với nồng độ muối (NaCl) tăng dần: 0%, 3%, 6%, 8% và 10%. Chuẩn bị huyền phù có khuẩn lạc cần nhận dạng và cấy nhẹ vào mỗi ống. Ủ ở 37⁰C trong 24h. Nếu quan sát thấy đục chứng tỏ vi khuẩn nghi ngờ có thể phát triển với nồng độ natri clorua có mặt trong ống đựng nước pepton muối.

Vibrio Cholera cho phản ứng dương tính (+) giảm dần theo nồng độ muối

 

Thử nghiệm sinh hóa bằng kit test nhanh nkIDS 14 GNR

• Thực hiện thử nghiệm và đọc kết quả theo sách hướng dẫn đính kèm.

 

6.1.5. Khẳng định huyết thanh:

 

Loại trừ chủng tự ngưng kết:

• Nhỏ 1 giọt dung dịch nước muối sinh lý lên lam kính sạch.
• Dùng que cấy vòng trộn đều dung dịch với khuẩn lạc cần thử, để thu được huyền phù đục và đồng nhất.
• Lắc nhẹ lam kính từ 30-60s. Nếu có sự kết dính các đơn vị với nhau thì chủng này được xem là tự ngưng kết, và sẽ không thử nghiệm tiếp vì không thể phát hiện kháng nguyên.

Kháng nguyên O1, O139:

• Thực hiện tương tự như 6.1.5.1, thay thế nước muối sinh lý thành kháng nguyên. Nếu xuất hiện ngưng kết thì được xem là dương tính
• Các chủng  choleraephân lập có phản ứng ngưng kết dương tính được phân loại là V. cholerae O1
• Các chủng cấy cho phản ứng âm tính với kháng huyết thanh O1 được thử nghiệm thêm về khả năng ngưng kết bằng kháng huyết thanh cholerae O139. Các chủng V. cholerae cho phản ứng ngưng kết dương tính là được phân loại là V. cholerae O139
• Các chủng phân lập cho kết quả âm tính với cả kháng huyết thanh O1 và huyết thanh thanh O139 được chỉ định chung là  choleraenon-O1/non-O139.

 

6.2. Thực hiện mẫu kiểm soát

 

6.2.1. Mẫu môi trường

• Ủ các môi trường BA, CAV, TCBS, APW dung dịch pha loãng ở nhiệt độ và thời gian tương tự như ủ mẫu thử nghiệm.
• Kết quả phân tích mẫu môi trường được ghi nhận vào biểu mẫu theo dõi tương tự như phân tích mẫu.
• Mẫu môi trường đạt yêu cầu khi không có sự xuất hiện biểu hiện đặc trưng cho chỉ tiêu phân tích trong môi trường sau khi nuôi ủ.
• Nếu kết quả của mẫu môi trường bị nhiễm, thì phải kiểm tra môi trường và tiến hành phân tích lại.

 

6.2.2. Mẫu trắng phòng thí nghiệm

• Tiến hành phân tích mẫu trắng tương tự như phần mẫu thử nghiệm 6.1.
• Kết quả phân tích mẫu trắng được ghi nhận vào biểu mẫu theo dõi tương tự như phân tích mẫu.

 

6.2.3. Mẫu chứa mật độ vi sinh vật cụ thể (đối chứng dương)

• Tiến hành phân tích mẫu đối chứng dương định kì 1 lần trong 1 lô mẫu
• Mẫu được xử lí và phân tích tương tự như phần mẫu thử nghiệm 6.1.
• Kết quả phân tích đối chứng dương được ghi nhận vào biểu mẫu theo dõi tương tự như phân tích mẫu.
• Đối chứng dương đạt yêu cầu khi có sự xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng cho chỉ tiêu phân tích trong môi trường sau khi nuôi ủ.
• Nếu kết quả âm tính, thì phải kiểm tra lại mẫu và tiến hành phân tích lại.

 

Công ty TNHH Thương Mại Dịch Vụ Tư vấn Môi Trường Tân Huy Hoàng 

Tự hào là Đơn vị tiên phong về chất lượng, uy tín hàng đầu và giá rẻ nhất hiện nay. Với kinh nghiệm lâu năm trong ngành. Tân Huy Hoàng cam kết cung cấp cho Quý Khách hàng các sản phẩm phù hợp nhất, chất lượng cao nhất.  Phù hợp với đặc điểm từng ngành nghề sản xuất với giá thành cạnh tranh, hiệu quả và tiết kiệm chi phí nhất. Chúng tôi có đội ngũ chăm sóc khách hàng chu đáo. Đội ngũ kỹ thuật tư vấn có chuyên môn với từng ngành nghề sản xuất. Và đội ngũ giao hàng nhanh chóng sẽ luôn mang đến sự hài lòng cho Quý Khách hàng. Để được sự tư vấn hoàn toàn miễn phí. Quý khách hàng xin vui lòng liên hệ  0902.695.765 – 0898.946.896 (Ms. HẢI YẾN).

————————————-

Dịch vụ trọn gói – Giá cả cạnh tranh – Chất lượng vượt trội

Còn chần chờ gì nữa mà không liên hệ với chúng tôi. Để nhận  được sự tư vấn nhiệt tình về các vấn đề môi trường. Cùng mức giá cạnh tranh nhất thị trường miền Nam?

 

Liên hệ ngay:

Hotline: 0902 695 765 – 0898 946 896 (Ms.Yến)

Fanpage: Tư Vấn Môi Trường Tân Huy Hoàng

 

Tham khảo thêm các dịch vụ khác tại đây